Asadpour, R., S. Kalantari, A. A. Shahbazfar & R. Jafari-Jozani, 2022. Co-supplementation of freezing media with trehalose and vitamin C on cell viability and apoptotic gene expression in ovine spermatogonial stem cells. Bulg. J. Vet. Med., 25, No 4, 593-602.

 

DOI: 10.15547/bjvm.2020-0068

 

The purpose of this research was to investigate the trehalose and vitamin C (Vit C) co-supplementation of freezing media to create a successful cryopreservation protocol for conservation of ovine spermatogonial stem cells (SSCs). SSCs were cryopreserved and cultured with an essential freezing medium containing 200 mM trehalose, 40 µg/mL Vit C, and a combination of both for 3 weeks. Cell viability, colony number and diameter and mRNA levels of Bax, and Bcl-2 genes were evaluated before and after cryopreservation with quantitative real-time PCR. The results showed that cells cryopreserved in freezing medium containing 200 mM of trehalose plus 40 µg/mL Vit C had considerably greater cell viability than the control group (P<0.0001). Up to the 3^rd week of cell culture, supplementation of freezing medium with 200 mM trehalose resulted in significantly lower colonies diameters than in the control group. No significant differences were observed during the 1^st to 2^nd weeks in colony diameter and number of colonies between cells cryopreserved in the freezing medium containing either Vit C or trehalose compared with the control groups. Following thawing, the mRNA level of Bax in the Vit C + trehalose group was drastically lower than in those treated with trehalose or Vit C only (P<0.0001). High expression of Bcl-2 in the 40 µg/mL Vit C group was recorded in the thawed cells compared to the control group (P<0.0001). These findings indicate that the concomitant use of antioxidants and sugar in the freezing medium can improve the quality and viabi­lity of SSCs after freezing via different mechanisms. Further studies are needed to clarify apoptosis and cell biomarkers in SSCs during freezing and thawing.

Key words: cryopreservation, spermatogonial stem cell, trehalose, vitamin C

 

Asadpour, R., S. Kalantari, A. A. Shahbazfar & R. Jafari-Jozani, 2022. Едновременно добавяне на трехалоза и витамин С към среда за замразяване върху клетъчната жизненост и апоптотичната генна експресия при овчи сперматогонни стволови клетки. Bulg. J. Vet. Med., 25, No 4, 593-602.

 

DOI: 10.15547/bjvm.2020-0068

 

Целта на това проучване бе да изследва съвместното добавяне на трехалоза и витамин C (Vit C) към среда за замразяване за създаване на успешен протокол за криосъхранение на овчи сперматогонни стволови клетки (SSCs). SSCs бяха криосъхранени и култивирани с есенциална среда за замразяване съдържаща 200 mM трехалоза, 40 µg/mL Vit C, и комбинация от двете за 3 седмици. Преди и след криосъхранението бяха оценени клетъчната жизненост, броят и диаметърът на колониите и mRNA нивата на гените Bax, и Bcl-2 чрез количествена PCR в реално време. Резултатите показаха, че клетките криосъхранени в среда за замразяване съдържаща 200 mM трехалози и 40 µg/mL Vit C имаха значително по-голяма клетъчна жизненост от контролната група (P<0.0001). До третата седмица на клетъчната култура, добавянето на  200 mM трехалоза към средата за замразяване  доведе до значително по-малък диаметър на колониите спрямо контролната група. Не бяха установени съществени различия през първата и втората седмици в диаметъра и броя на колониите между клетките, съхранени в среда за замразяване съдържаща само Vit C или само трехалоза в сравнение с контролните групи. След размразяване, нивото на mRNA на Bax в групата с Vit C + трехалоза бе драстично понижено в сравнение с групите третирани само с трехалоза или само с Vit C (P<0.0001). Висока експресия на Bcl-2 в размразените клетки бе установена в групата с 40 µg/mL Vit C спрямо контролата (P<0.0001). Tези данни показват, че едновременната употреба на антиоксиданти и захар в средата за замразяване може да подобри качеството и жизнеността на SSCs след замразяване посредством различни механизми. Нужни са още проучвания за изясняване на апоптозата и клетъчните биомаркери на SSCs по време на замразяване и размразяване.

Ключови думи: криосъхранение, сперматогонни стволови клетки, трехалоза, витамин C